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标题: 染色体微缺失微重复综合征遗传检测的发展现状如何？ [打印本页]

作者: 小音符 时间: 2017-2-10 10:19
标题: 染色体微缺失微重复综合征遗传检测的发展现状如何？

　　自20世纪80年代医学界首次发现染色体的微小缺失或重复可导致疾病的发生以来，有赖于人类基因组研究的深入及细胞分子检测技术的不断发展，微缺失微重复的临床意义也越来越得到重视。在近年精准医学兴起的背景下，临床检验工作者需加强对染色体微缺失微重复相关疾病的了解，知晓有关检测技术优点和局限性，以便更好地为临床提供实验室支持。

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　　一、染色体微缺失微重复综合征概述

　　染色体微缺失微重复综合征是由于染色体微小片段缺失或重复，使正常基因剂量发生改变而导致的具有复杂临床表现的一组染色体病。其常见临床表现有：生长发育异常、智力发育迟缓、内脏器官畸形、特殊面容、内分泌异常、精神行为改变和肿瘤等。该类疾病目前已发现近300种，发病率在1/200 000～1/4 000不等，合并发病率近1/600。其遗传特点常为显性发病，以新发突变为主(约占85%～95%)，家族性遗传约占5%～10%。

　　二、染色体微缺失微重复遗传检测主要技术

　　微缺失微重复综合征其染色体畸变一般小于5 000 000 bp，传统的染色体核型分析分辨率较低，只能依赖于细胞分子遗传技术或分子遗传技术进行检测。目前，临床上应用于微缺失微重复综合征检测的技术主要有下列几种。

　　1.荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)：

　　FISH是最早应用于微缺失微重复综合征检测的技术。该技术原理是利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与目标样本的互补DNA杂交，通过观察荧光信号在染色体上的位置与数目反映相应染色体片段的情况。与传统核型分析比较，FISH技术的优势主要表现于：(1)可检测出小于5 000 000 bp片段的染色体微缺失或微重复;(2)不需细胞培养，可以缩短诊断所需的时间。目前，FISH技术主要用于验证基因芯片等技术筛检出来的染色体微缺失微重复片段。

　　2.染色体微阵列芯片技术(chromosomal microarray，CMA)：

　　CMA能在全基因组水平上对染色体片段缺失或重复进行检测，可发现大量未知的、导致异常表型的染色体微缺失微重复。根据采取的技术路线不同，主要有比较基因组杂交芯片(array–comparative genomic hybridization，array–CGH)和单核苷酸多态性芯片两种平台。其检测分辨率远远高于传统核型分析和FISH技术(具体分辨率取决于采用的芯片种类);自动化程度高，结果判断相对客观。美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)等多个学术组织已将CMA作为微缺失微重复综合征检测的一线推荐技术。

　　但CMA也存在一些局限，如：不能分析平衡异位、倒位等染色体结构异常;受限于其探针覆盖范围，可能导致不同染色体片段间检测分辨率的差别;结果解读需要较强的临床经验和医学遗传学理论水平。值得一提的是，近几年兴起的一种基于液态悬浮芯片原理的细菌人工染色体标记–磁珠鉴别/分离(bacterial artificial chromosome on beads，BoBs)技术，能够以相对简单的操作检测几十种临床意义明确的微缺失微重复综合征，正逐步获得临床的应用和认可。

　　3.实时荧光PCR技术(real–time PCR)：

　　real–time PCR检测微缺失微重复的原理是设计2对引物和标记不同荧光基团的探针分别检测目标染色体上的序列和对照染色体上的序列(通常为看家基因序列)。通过循环阈值(ΔCt)的差值判断染色体片段的数目异常。此方法简单快速、廉价易行。但也存在一些缺点，容易出现假阳性或假阴性的检测结果。同时，因为波长范围的影响，同一反应中共存的荧光基团的种类有限，使得检测通量十分有限。

　　4.多重连接依赖探针扩增技术(multiplex ligation–dependent probe amplification，MLPA)：

　　MLPA是针对目标基因和内参基因上的序列设计若干对相邻的寡核苷酸杂交探针，通过连接反应后可形成数十条长度不等的可供扩增的杂交探针。运用同一对引物对这些长度不同的杂交探针进行扩增后，经过毛细管电泳分析扩增产物，最后通过电泳图谱上不同产物峰的相对面积即可获得微缺失微重复的检测结果。相比real–time PCR，该技术的准确度得到较大提高。其不足之处一是试剂主要依赖国外进口，成本较高;二是其需使用毛细管电泳进行结果分析，检测通量较低，限制了这项技术在临床的大范围推广。

　　5.高通量测序技术(next generation sequencing，NGS)：

　　NGS可以一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，该技术已普遍用于各类物种基因组测序、分子育种及临床研究。通过测序深度的调整，NGS分辨率可达到1 bp～1 000 000 bp之间，为分析染色体微小缺失和重复提供了有效的手段。如Kunze等运用测序技术阐述了Xq26.3微缺失会影响PHF6基因及miR–424在骨髓增生异常综合征中的表达引人注目的是，随着NGS平台及数据处理方式的发展，NGS在微缺失微重复的无创产前检测中也迅速得以应用。如高通量测序可用于GJB2基因微缺失导致耳聋的无创产前检测。尽管高通量测序技术有诸多优势，但其仍具有一些尚待解决的局限性：首先，高通量测序平台临床普及度仍不够广泛，成本仍较高;其次，虽测序通量有质的飞跃，但后续的大量测序数据的分析确却成为临床工作者所面临的一大难题。然而，随着测序技术的改进发展以及数据处理软件的完善，相信这些问题将能够很快解决。届时，高通量测序技术在染色体微缺失微重复综合征的检测领域将发挥不可或缺的重要作用。

　　三、染色体微缺失微重复检测的临床应用

　　1.儿科遗传病领域的临床应用：

　　染色体微缺失微重复是儿童先天性畸形及智力障碍的主要原因。儿童患者原因未明的发育迟缓/智力障碍、自闭症、多发先天性畸形中，12%存在有临床意义的染色体微缺失微重复。因此，染色体微缺失微重复的检测对儿科临床遗传学研究非常重要。儿科中，除了症状比较明确或者遗传因素比较确定的患者可采用FISH、MLPA等以目标基因检测为主的技术外，对于大部分不明原因患儿，建议采用CMA从整个基因组层面对染色体拷贝数变化进行扫描，能够有效提高致病因素的检出率。

　　2.出生缺陷防控领域的临床应用：

　　尽管产前诊断技术和围产期治疗模式有所进步与完善，出生缺陷仍然是引起新生儿发病和死亡的主要原因之一。染色体微缺失微重复的检测在出生缺陷防控中具有重要意义，如：(1)反复流产、死胎、死产人群的遗传检测;(2)曾生育过不明原因智力落后、发育迟缓、多发畸形或类似综合征患儿的人群的病因学检测;(3)超声检测异常胎儿的产前诊断;(4)出生缺陷新生儿的遗传筛查。

　　目前临床应用较多的是对超声高风险胎儿的产前诊断，推荐采用CMA技术，可对胎儿遗传状况获得大量的数据，有利于临床处理。但对一些临床意义不明确的微缺失微重复，结果判读和临床处理时面临较大的伦理学困境。

　　3.肿瘤领域的临床应用：

　　肿瘤是细胞生长分化紊乱形成的新赘生物，来源于生殖系或体系细胞突变。随着当前精准医学发展，临床对肿瘤遗传背景的研究越来越深入。染色体微缺失微重复可导致基因组紊乱，并认为是导致肿瘤发生的重要原因之一。多个研究表明，急性淋巴细胞白血病、乳腺癌和肠癌等癌细胞中均发现有不同数量的染色体微缺失或微重复。这些发现，尤其是涉及激酶基因的，提示可以成为药物靶点。生殖系细胞突变看，有研究发现1q21.1与神经母细胞瘤有关，涉及NBPF23的表达。这些研究均提示肿瘤临床检测中染色体微缺失微重复检测的重要性。

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　　四、展望

　　染色体微缺失微重复综合征是临床合并发病率较高的一类染色体病，对其的检测技术也在不断发展。尤其是近十年，基因芯片技术和高通量测序技术的产生和发展，使临床识别的潜在的微缺失微重复综合征的比例显著增加。如何正确地选择检测技术，为临床提供更为准确可靠的实验室依据，还需要广大临床检验者共同努力。

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